Contenido
- Detección mediante cambios de color
- Utilizando un lector de ELISA para la medida
- ELISA competitivo directo (citocromo c)
- Incubar el anticuerpo primario en tubos
La prueba de ELISA es un ensayo inmunosorbente ligado a enzimas que utilizan anticuerpos o antígenos acoplados a una enzima específica para ayudar a determinar la concentración de anticuerpos o antígenos. Si usted está haciendo una prueba de ELISA y no puede utilizar anticuerpos específicos para obtener sus resultados, se sugiere el ELISA competitivo, porque utiliza un antígeno conjugado a una enzima en lugar del anticuerpo, y un método de detección diferente.
Detección mediante cambios de color
Un protocolo común para el ELISA competitivo es utilizar un anticuerpo primario no marcado y purificado. El anticuerpo cubre los pocillos de una placa de microtitulación y se incuba con patrones desconocidos. Un inmunógeno se agrega después para combinarse con el anticuerpo primario, el cual se unirá a los sitios del anticuerpo que aún no estén ocupados. Un sustrato se utiliza para crear un cambio de color para medir la concentración de la conexión.
Utilizando un lector de ELISA para la medida
Utilice una placa de poliestireno de micro-titulación y añada el anticuerpo primario en cada pocillo. Para alcanzar la conexión máxima, llene el pocillo con un micrograma del anticuerpo. Incubar la placa durante cuatro horas a temperatura ambiente. Añada el anticuerpo de captura primaria y lave los pocillos con PBS (tampón fosfato salino). Incubar las placas con tapón de bloqueo durante dos horas a temperatura ambiente. Lave los pocillos de nuevo dos veces con PBS y añada los patrones. Coloque la solución de antígeno-conjugado en los pocillos e incube otra vez durante dos horas. Lave la placa nuevamente con PBS cuatro veces. Añada el sustrato y mida las densidades en la longitud de onda específica usando un lector de ELISA.
ELISA competitivo directo (citocromo c)
Para un ELISA competitivo directo, un análisis de dilución sérica para el antígeno que usted está usando en el experimento debe ser ejecutado. La placa de micro-titulación, a continuación, se recubre con citocromo c e incubada durante la noche. La parte ELISA del ensayo se realiza mediante la adición de reactivo de bloqueo y anticuerpos secundarios. Los resultados de la absorbancia se leen con un lector de micro placas.
Incubar el anticuerpo primario en tubos
En este procedimiento, el anticuerpo primario se incuba en tubos de ensayo en los que el antígeno de interés se une a él. Las muestras se añaden a los pocillos de las placas de micro-titulación e incubadas. Los pocillos se limpian para eliminar los complejos antígeno-anticuerpos no conectados y, a continuación, se añade la solución de bloqueo para evitar que el segundo anticuerpo se conecte a los pocillos. El anticuerpo secundario se lee en un lector de placas para obtener los resultados.